Методы контраста в световой микроскопии: как увидеть невидимое
Большинство биологических объектов — клетки, ткани, микроорганизмы — практически прозрачны в обычном свете. Без специальных методов контраста исследователь видит лишь размытое изображение без деталей. Эта статья поможет разобраться, какие методы контрастирования существуют, в чём их принципиальные различия и когда применяется каждый из них.
Зачем нужен контраст в микроскопии
Световая микроскопия основана на взаимодействии светового пучка с исследуемым объектом. Проблема состоит в том, что живые клетки и тонкие срезы тканей поглощают свет крайне слабо и имеют показатель преломления, близкий к показателю преломления воды. В результате амплитуда световой волны почти не изменяется при прохождении через образец, и изображение получается малоинформативным (1).
Методы контраста решают эту задачу по-разному: одни преобразуют фазовые изменения волны в амплитудные, другие используют избирательное поглощение красителей, третьи задействуют явление флуоресценции. Выбор метода определяется природой объекта, целью исследования и типом используемого микроскопа.
Светлопольная микроскопия и окрашивание
Светлопольная микроскопия — исторически первый и наиболее распространённый метод. Образец освещается снизу, а объектив собирает прошедший свет. Сам по себе метод даёт низкий контраст для нефиксированных препаратов, поэтому его почти всегда сочетают с химическим окрашиванием (2).
Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) остаётся стандартом в гистологии: гематоксилин окрашивает ядра в синий цвет, эозин — цитоплазму в розовый. Метод прост, воспроизводим и позволяет оценивать морфологию тканей при патологоанатомических исследованиях. Однако фиксация и окрашивание убивают клетку, что исключает наблюдение живых процессов.
Фазово-контрастная микроскопия
Фазово-контрастная микроскопия была разработана в 1930-х годах Фрицем Цернике и позволила наблюдать живые неокрашенные клетки. Метод основан на том, что свет, проходя через объект с иным показателем преломления, сдвигается по фазе. Специальная фазовая пластина в объективе преобразует этот сдвиг в разницу яркостей, делая структуры видимыми (1).
Как отметил сам Фриц Цернике в своей Нобелевской лекции 1953 года: «Фазовый контраст открыл возможность наблюдать живые клетки без какого-либо вмешательства в их жизнедеятельность» (Нобелевская лекция, Нобелевский комитет, 1953).
Метод широко применяется в клеточной биологии, при культивировании клеток и изучении подвижности микроорганизмов. К ограничениям относятся характерные «гало»-артефакты вокруг крупных объектов и снижение качества изображения при работе с толстыми образцами.
Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК)
Метод ДИК (Номарского) использует поляризованный свет и призмы Номарского для разделения луча на два пучка, проходящих через соседние точки образца. После рекомбинации разница фаз между ними создаёт псевдотрёхмерное изображение с выраженным рельефом (2).
ДИК особенно эффективен при работе с толстыми образцами и позволяет получать оптические срезы. Метод не даёт «гало»-артефактов, характерных для фазового контраста, и обеспечивает высокое пространственное разрешение. Ограничение — невозможность использования пластиковых культуральных планшетов из-за их двойного лучепреломления.
Тёмнопольная микроскопия
В тёмнопольной микроскопии центральный световой конус блокируется специальным конденсором, и объектив собирает только свет, рассеянный объектом. На тёмном фоне объекты выглядят яркими. Метод чувствителен к мелким деталям и позволяет визуализировать структуры размером менее 200 нм, недоступные при обычном освещении (1).
Тёмное поле традиционно применяется для изучения бактерий, спирохет и коллоидных частиц. Метод не требует окрашивания, однако чувствителен к загрязнениям препарата, которые также рассеивают свет и создают помехи.
Флуоресцентная микроскопия
Флуоресцентная микроскопия основана на способности определённых молекул поглощать свет одной длины волны и испускать свет другой, большей длины волны. Образец освещается возбуждающим светом, а специальный фильтр пропускает только флуоресцентное излучение (3).
Метод позволяет избирательно метить конкретные белки, органеллы или нуклеиновые кислоты с помощью флуоресцентных красителей или генетически кодируемых белков (например, GFP). Это делает флуоресцентную микроскопию незаменимым инструментом молекулярной и клеточной биологии. Основное ограничение — фотообесцвечивание флуорофоров при длительном освещении.
Сравнительная таблица методов контраста
| Метод | Тип образца | Живые клетки | Основное применение |
|---|---|---|---|
| Светлое поле + окрашивание | Фиксированный | Нет | Гистология, патология |
| Фазовый контраст | Живой / нефиксированный | Да | Клеточные культуры |
| ДИК (Номарского) | Живой / толстый срез | Да | Эмбриология, нейробиология |
| Тёмное поле | Живой / нефиксированный | Да | Бактериология |
| Флуоресценция | Живой / фиксированный | Да/нет | Молекулярная биология |
Как выбрать метод
Выбор метода контрастирования определяется прежде всего задачей исследования. Если необходимо изучить морфологию фиксированной ткани — достаточно светлопольной микроскопии с окрашиванием. Для наблюдения живых клеток в культуре оптимален фазовый контраст или ДИК. Когда требуется локализовать конкретный белок или структуру — применяют флуоресцентную микроскопию (3).
Важно учитывать и технические параметры микроскопа: не каждый прибор оснащён необходимыми конденсорами, объективами и фильтрами. Современные лабораторные микроскопы нередко совмещают несколько методов контраста в одной платформе, что существенно расширяет возможности исследователя.
Список использованных материалов
- Murphy D.B., Davidson M.W. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. 2nd ed. Wiley-Blackwell, 2012.
- Pawley J.B. (ed.) Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd ed. Springer, 2006.
- Lichtman J.W., Conchello J.A. Fluorescence microscopy // Nature Methods. 2005. Vol. 2, No. 12. P. 910–919.